Wntcatenin信号在Mdr2

Wnt/β-catenin信号在Mdr2-KO小鼠胆汁淤积性肝病模型中的保护作用

汇报人：硕士研究生一年级梁艺瑶

宾夕法尼亚州匹兹堡大学的TirthadipaPradhan-Sundd于年5月在Hepatology报道了Wnt/β-catenin信号通路可以抑制胆汁酸(BA)的合成，从而阻止小鼠胆管结扎(BDL)后胆汁淤积性肝损伤和纤维化的发展。在Mdr2基因敲除(KO)小鼠中抑制β-catenin（KD）会加剧胆汁淤积性肝病的发生和发展。

原发性硬化性胆管炎(PSC)是一种以肝内外胆管炎症和纤维化为特征的慢性胆汁淤积性肝病，目前肝移植是PSC的唯一治疗方式，药物治疗方法亟待开发。Mdr2基因(Mdr2KO)敲除的小鼠表现出明显的PSC[1-2]病理特征，是评估和验证PSC相关信号通路以及开发相关治疗策略的良好模型。Wnt信号通路的激活影响胆汁淤积性肝病的发展，β-catenin是Wnt信号通路的主要下游效应因子，它还是粘附连接(AJ)的一部分，连接了肝细胞表面的肌动蛋白细胞骨架和E-钙粘蛋白。本文中KO/KD小鼠与KO小鼠相比，肝和胆管损伤加剧，表现为肝脏血清生化指标紊乱、炎症和纤维化、胆管反应、再生受损；BA转运蛋白和解毒/合成酶存在明显的失调，但BA总水平不变；血液和胆汁在肝窦内混合导致血清BA升高；肝细胞连接完整但肝脏胆小管形态异常。本文强调了β-catenin在胆汁淤积性损伤中维持肝脏结构完整性和促进肝胆修复中的重要作用。

文章内容

01

抑制β-catenin可加剧Mdr2KO小鼠的肝胆损伤

为了评估抑制β-catenin是否能延缓或防止胆汁淤积性肝病的肝胆损伤，作者使用了两种β-catenin抑制剂处理Mdr2KO小鼠和WT小鼠，分别采用静脉注射β-cateninDsiRNA的脂质纳米颗粒以及皮下注射β-cateninDsiRNA与N-乙酰半乳糖胺，给药两次后5天或7天处死小鼠(图1A)。mRNA分析表明，KO肝脏中Mdr2的表达显著降低(图1B)。免疫荧光(IF)证实了肝细胞中两种β-catenin抑制剂的抑制效果(图1C)。作者还分析了两种β-catenin抑制剂处理的Mdr2KO小鼠的血清生化指标，与安慰剂组相比，肝损害(ALT、AST)和胆道损害(ALP、胆红素)指标均明显升高，表明肝损伤恶化。采用两种方法处理的Mdr2KO小鼠和Mdr2KO/β-catenin基因敲除(KO/KD)小鼠的肝脏重量与体重的比率没有显著差异(图1D)。

图1

敲除β-catenin可加剧Mdr2KO小鼠的肝胆损伤。

(A)β-cateninDsiRNA在Mdr2KO小鼠体内不同给药方式。(B)qPCR显示β-catenin抑制前后KO小鼠肝组织Mdr2基因的表达均显著低于WT小鼠。(C)IF表明基因敲除后，WT小鼠肝细胞内β-catenin减少。(D)与Mdr2KO小鼠相比，KO/KD小鼠的肝脏重量/体重(LW/BW)比率保持不变。KO/KD小鼠血清ALP、ALT、AST、总胆红素和结合胆红素水平明显高于Mdr2KO小鼠。**p0.01；****p0.。

02

KO/KD小鼠的肝脏实质损伤，炎症和纤维化增加，出现胆管反应

Mdr2KO小鼠与WT小鼠相比有胆管反应，SOX9免疫组织化学（IHC）表明KO/KD小鼠与Mdr2KO小鼠相比，肝胆汇管区内胆管细胞数量显著增加(图2A)。CD45IHC显示KO/KD小鼠胆管周围和肝实质有强烈的炎症反应，肝脏纤维化也加剧(图2A、B)；促炎细胞因子IL-6和TNF-αmRNA在KO/KD小鼠肝脏中也显著增加(图2C)。这些发现表明Mdr2KO小鼠缺乏β-catenin会加剧肝脏损伤的发生。

图2

KO/KD小鼠的肝脏实质损伤，炎症和纤维化增加，出现胆管反应。

(A)HE染色显示KO/KD小鼠肝实质损伤较WT小鼠或KO小鼠增加；SOX-9的IHC显示KO/KD小鼠肝脏门脉周围区域有更多的胆管肿块；天狼星红和CD45IHC显示KO/KD小鼠肝脏的纤维化和炎症增加。(C)天狼星红和CD45的定量分析进一步证实了组织学分析的结果。(C)定量PCR分析显示KO/KD小鼠肝脏中促炎细胞因子IL-6和TNFα的mRNA表达水平升高。*p0.05；***p0.；****p0.。

03

KO/KD小鼠再生受损，出现β-catenin阳性肝细胞簇

在遭受慢性损伤的肝脏中，肝细胞的再生能力对于持续肝功能至关重要，β-catenin通过cyclinD1转录调控肝细胞增殖。PCNAIHC表明Mdr2KO小鼠肝细胞大量增殖，而KO/KD小鼠肝细胞增殖受到显著抑制；TUNEL染色显示KO/KD小鼠与Mdr2KO小鼠相比，肝脏中的细胞死亡增加(图3A)。IHC表明β-catenin虽然在KO/KD小鼠肝细胞中缺失，但在胆管细胞中仍有表达(图3B)。尽管β-catenin在没有损伤的情况下被有效地敲除，但门脉周围区域的部分肝细胞β-catenin染色也呈阳性(图1C)。这些肝细胞体积小，核浆比高(图3B，插图)，没有完全分化，谷氨酰胺合成酶(GS)是β-catenin的转录靶点和成熟肝细胞的标志[3]，在KO/KD小鼠肝脏中缺乏表达(图3B)。

图3

KO/KD小鼠肝脏再生反应受损。

(A)PCNA的IHC显示Mdr2KO小鼠肝细胞大量增殖，KO/KD小鼠肝细胞增殖显著减少。TUNEL染色显示KO/KD小鼠肝细胞死亡多于Mdr2KO小鼠。(B)IHC表明，与WT小鼠或KO小鼠相比，β-catenin在KO/KD小鼠肝细胞中的表达显著降低；与WT小鼠相比，Mdr2KO小鼠的GS染色减少，KO/KD小鼠肝脏中没有GS染色。****p0.。

04

在KO/KD小鼠中β-catenin的丢失被粘附连接(AJ)的γ-catenin补偿

胆汁淤积改变了肝细胞连接的结构和功能[4]，因此作者研究了KO/KD小鼠肝脏连接的完整性。作者用Westernblot(WB)表明β-catenin在KO/KD小鼠肝细胞中表达缺失(图4A)；Mdr2KO小鼠与WT小鼠对比，β-catenin蛋白和mRNA的表达增加(图4A，D)。γ-catenin是AJ的一个结构成分，可以补偿AJ的β-catenin的丢失，以维持细胞之间的粘附，在WT小鼠和Mdr2KO小鼠中低水平表达的γ-catenin蛋白在KO/KD小鼠肝脏中显著增加(图4B)。qPCR证明，增加的γ-catenin表达被翻译后修饰调节(图4D)。经WB和qPCR检测，Mdr2KO小鼠的E-钙粘附素较WT小鼠略有升高，KO/KD小鼠的E-钙粘附素较KO小鼠无明显变化(图4C，D)。E-钙粘附素免疫沉淀表明，在KO/KD小鼠肝脏中γ-catenin与E-钙粘附素相关(图4E)。因此，肝细胞β-catenin的丢失不会影响KO/KD小鼠肝脏AJ的完整性。

图4

KO/KD小鼠肝脏AJ组成无明显变化。

(A)WB表明KO/KD小鼠中β-catenin活性和GS的缺失。(B)WB表明与WT小鼠或Mdr2KO小鼠相比，γ-catenin的在KO/KD小鼠肝中的表达显著上调。(C)WB和相应的定量结果显示Mdr2KO小鼠和KO/KD小鼠肝中E-钙粘附素蛋白表达上调。(D)KO/KD小鼠与KO小鼠的γ-catenin和E-钙粘附素mRNA的表达无显著差异，Mdr2KO小鼠的β-cateninmRNA表达增加，KO/KD小鼠的β-cateninmRNA表达降低。(E)从全肝裂解液中分离E-钙粘附素，然后进行WB和定量验证，结果表明KO/KD小鼠肝组织中E-钙粘附素与β-catenin的关联性降低，而E-钙粘附素与γ-catenin的关联性增加。**p0.01

05

KO/KD小鼠肝细胞紧密连接(TJ)完整

作者进一步分析了KO/KD小鼠中肝细胞TJ的完整性。经WB和qPCR检测，β-catenin的转录靶点Claudin-2在KO/KD小鼠肝脏中缺失(图5A)。其他TJ蛋白如Occludin和ZO-1在β-catenin缺失后略有增加，但不明显(图5B)。透射电子显微镜(TEM)显示Mdr2KO小鼠或KO/KD小鼠肝脏的AJ和TJ均无明显缺陷，KO/KD小鼠的胆小管较WT小鼠或KO小鼠明显扩张(图5C)。

图5

KO/KD小鼠肝组织中TJ完整。

(A)WB显示KO/KD小鼠肝脏Claudin-2缺失。(B)mRNA表达分析显示，KO/KD小鼠与KO小鼠相比，TJ蛋白、occludin和ZO-1表达略有增加，但差异不显著。(C)透射电镜显示KO/KD小鼠肝TJ结构完整，胆小管扩张。*p0.05。

06

KO/KD小鼠BA合成、代谢和转运基因表达失调，BA总水平不变

Mdr2KO小鼠是胆汁淤积性肝病的模型，其BA动态平衡会被破坏，因此作者评估了KO/KD小鼠中与BA合成和转运相关基因的表达，在有或没有β-catenin抑制的Mdr2KO小鼠中，BA合成的主要调节因子法尼醇X受体(FXR)的表达没有变化。FXR诱导小异二聚体伴侣重组蛋白(SHP)的表达，从而抑制Cyp7a1，抑制BA的合成，KO/KD小鼠与Mdr2KO小鼠相比，SHPmRNA的表达下降但不显著。参与BA解毒和转运的孕烷X受体(PXR)和组成型雄甾烷受体(CAR)受到抑制(图6A)。在缺乏β-catenin的情况下，受这些核受体调控的细胞色素P(Cyp)基因也会失调。与Mdr2KO小鼠相比，参与从胆固醇合成BA的Cyp7a1和Cyp8b1在KO/KD小鼠中都受到抑制；BA选择性合成的启动子Cyp27也会减少。Cyp3a11是PXR解毒疏水性BA的靶点，在KO小鼠或KO/KD小鼠中没有变化；Cyp2b10作为在胆汁酸解毒的CAR靶点，在使用β-catenin抑制剂后显著增加(图6B)。总之，这些发现表明KO/KD小鼠BA合成受到抑制，解毒作用增加，而这种作用不依赖于FXR。

在缺乏肝细胞β-catenin的Mdr2KO小鼠中，BA的转运也发生了改变。基底侧的牛磺胆酸钠共转运蛋白(NTCP)和有机阴离子转运肽-4(OATP4)在KO/KD小鼠中受到抑制，多药耐药相关蛋白2(MRP2)和胆汁酸盐输出泵(BSEP)等外排转运体的表达无明显变化，外流转运蛋白MRP3和MRP4在KO/KD小鼠肝脏中显著上调(图6C)，它们表达在基底外侧膜上，并在胆汁淤积条件下被诱导产生。由于BA代谢和转运的改变(图6D)，肝脏中的总BA水平在β-catenin抑制后没有变化(图6E)。因此，KO/KD小鼠的损伤增加不是由肝脏BA负荷增加所致。

图6

KO/KD小鼠肝脏中与BA合成、代谢和转运相关基因的失调。

(A)qPCR分析显示KO/KD小鼠肝脏中几种参与BA调节的核受体表达降低。(B)P表达分析显示在KO/KD小鼠肝脏BA合成受到抑制，解毒作用增强。(C)qPCR显示，KO/KD小鼠肝脏对BA的摄取受到抑制，基底外侧流出增加。(D)A、B和C中qPCR分析的表格表示。(E)KO/KD小鼠和KO小鼠的肝脏BA水平没有变化。*p0.05；**p0.01；***p0.；****p0.。

07

KO/KD小鼠肝窦内血液和胆汁混合，血清BA水平升高

为了证实TJ是完整的，并确定转运蛋白失调对KO/KD小鼠中BA摄取和外排的影响，作者利用多光子活体显微镜观察了小鼠的血液和胆汁流动。在WT小鼠和Mdr2KO小鼠中，6-羧基二乙酸荧光素（6-CFDA）被转运蛋白摄取，被肝细胞水解为羧基荧光素(CF)，CF在注射后2分钟分泌到胆小管，血液和胆汁流动也分别分布于肝窦和胆小管；在KO/KD小鼠肝脏中，CF在摄取和水解后立即从肝细胞的基底外侧表面流出，导致血液和胆汁混合在肝窦中，CF很少被输送到胆小管(图7A)。KO/KD小鼠的血清BA水平显著升高证实了这一发现(图7B)。肝细胞间细胞旁无渗漏表明KO/KD小鼠中TJ是完整的，KO/KD小鼠胆汁迅速回流入血液，血清BA水平升高，可能是因为MRP3和MRP4表达增加，从血液中摄取基底侧方的BA减少导致的。

图7

肝细胞中β-catenin和Mdr2的双重缺失导致胆汁排入肝窦。

(A)WT小鼠肝的时间序列图像(1M、3M和10M）分别显示CF(绿色)和葡聚糖-德克萨斯红(红色)在胆小管和肝窦内的定位。(B)KO/KD小鼠血清BA水平明显高于KO小鼠(*P0.05；***P0.)。

08

KO/KD小鼠肝脏胆小管形态异常

肝细胞极性缺陷会加重胆汁淤积，作者用免疫荧光检测ZO-1，ZO-1指导上皮极化和管腔形成[5]。免疫荧光(IF)表明WT小鼠肝显示典型的小管周的定位，可见小管两侧的一对平行线；Mdr2KO小鼠的这种轨道形态是相似的；在KO/KD小鼠中观察到软木塞形状的ZO-1染色图案，表明胆小管扭曲(图8A)。CD10是另一种胆小管标志物，免疫组化（IHC）显示WT小鼠相邻肝细胞之间有明显的膜性染色，主要在第1区[6](图8B)。Mdr2KO小鼠肝脏在更小的染色范围内显示相似的染色模式，而KO/KD小鼠显示小管CD10定位几乎完全消失(图8B)。扫描电子显微镜（SEM）也证实了在缺乏Mdr2KO和β-catenin的情况下有明显的胆小管缺陷。KO/KD小鼠与WT小鼠和Mdr2KO小鼠相比，微绒毛的数量和结构没有变化，胆道更扩大和弯曲盘旋。

图8

KO/KD小鼠肝脏中胆小管异常。

(A)在WT小鼠和Mdr2KO小鼠中ZO-1IF显示小管周定位；在KO/KD小鼠肝脏中，ZO-1IF显示胆小管的曲折和螺旋形。(B)CD10IHC表明WT小鼠肝细胞之间显示明显的深棕色染色图案；在Mdr2KO小鼠中也存在；在KO/KD小鼠中CD10染色几乎完全缺失。(C)扫描电镜图像显示，与WT小鼠和Mdr2KO小鼠相比，KO/KD小鼠肝脏的胆小管扭曲和扩大。

总结与思考

在肝脏胆汁淤积模型中维持小鼠肝功能的关键在于减轻肝脏损伤和改善再生反应，保持胆汁流动，Wnt/β-catenin信号通路在胆汁淤积性肝病中可能起到保护作用，抑制这一途径可能会导致损伤的加重。中药的安全性是影响其临床应用的关键因素，一些中药如雷公藤、何首乌、山豆根等在应用中出现了明显的肝毒性，中药的肝脏毒性机制涉及胆汁淤积、氧化应激、炎症反应、肝药酶影响等多个方面，本文阐述的Wnt/β-catenin信号通路在胆汁淤积中的作用，对我们探究中药肝毒性机制并寻找解毒方法具有一定的启示作用。

参考文献

[1]SmitJJ,SchinkelAH,OudeElferinkRP,etal.Homozygousdisruptionofthemurinemdr2P-glycoproteingeneleadstoa

转载请注明：http://www.jduhu.com/dgywh/13364.html