综述低剂量IL2治疗移植,自身免疫

报名：多因子检测金标准MSD中国区讲座

调节性T细胞（Tregs）在诱导和维持免疫稳态和自我耐受中起着重要作用。Tregs持续表达对IL-2的高亲和力受体。IL-2是一种多效性细胞因子，是Tregs的关键生存因子。它通过促进Foxp3的表达和随后产生的免疫调节细胞因子来维持Tregs的抑制功能。低剂量的IL-2被证明是预防同种异体排斥反应和治疗自身免疫和炎症的有效方法。IL-2与mAb（JES6-1）的结合还可以增加IL-2的t1/2（半衰期），进一步提高Treg频率和功能。低剂量IL-2治疗已用于治疗丙型肝炎血管炎、移植物抗宿主病、1型糖尿病和系统性红斑狼疮等疾病。本文就低剂量IL-2在角膜移植中的应用作一综述，并对近年来低剂量IL-2在角膜移植、自身免疫和其他炎症反应中的应用作一综述。我们还讨论了进一步研究的潜在领域，以期优化目前的低剂量IL-2方案。

调节性T细胞（Tregs）是T细胞的一个亚群，以Agspecific的方式介导免疫抑制，包括对自身抗原（自身免疫）、外来Ags（病原体或同种抗原）和肿瘤的免疫反应。因此，长途跋涉在维持免疫内环境平衡和自我耐受方面起着中心作用。其特征是CD4、CD25和转录因子Foxp3（1）的表达。Foxp3是一个转录调节因子家族，其蛋白产物，浮渣蛋白，对正常的免疫稳态是必不可少的。Foxp3在坏血病小鼠和免疫失调、多内分泌病变、肠病和X-连锁综合征患者中不存在。Foxp3基因突变也与其他自身免疫性疾病有关，如1型糖尿病（T1D）、过敏症和人类炎症性肠病（2-5）。Foxp3在外周树突状细胞的发育和分化以及维持树突状细胞的抑制功能中起重要作用（6）。CD41CDT细胞、NK细胞和CD81CTL只表达IL-2R的b链和g链，在微环境中与IL-2结合的亲和力较低。因此，低浓度的IL-2选择性地激活Tregs，而高剂量的IL-2则使Tregs、效应T细胞（Teffs）、NK细胞和CTLs扩张（7，8）。多项研究表明，Treg缺乏可导致人和小鼠自身免疫性的发展，并且Treg功能的缺陷已在许多炎症条件下被发现，包括系统性红斑狼疮（SLE）、T1D和慢性肾病（9，10）。低剂量IL-2在体内扩增CD41CDFoxp31-Tregs，在控制炎症和诱导免疫耐受方面显示出良好的效果。这种方法绕过了以往过继转移treg方法的主要障碍，因为treg在淋巴组织中的频率相对较低，需要在过继转移前进行体外扩张。长时间体外扩增Tregs本身可导致Foxp3表达减少和抑制功能下降（11）。IL-2是一种多效性细胞因子，最初发现于20世纪70年代，是一种T细胞生长因子。然而，20世纪90年代的进一步研究表明，缺乏IL-2、IL-2Ra或IL-2Rb基因的小鼠缺乏Tregs，并发展为严重的自身免疫（9，12）。IL-2是外周树突状细胞生存的关键因子，是维持其功能和稳定性的必要条件（9，13）。低剂量白细胞介素-2治疗自身免疫性疾病，如慢性难治性移植物抗宿主病（GVHD）、丙型肝炎病毒性血管炎和T1D（14-16）。自那时起，许多I/II期临床试验都集中于确定T1D和SLE患者低剂量IL-2的最佳剂量和给药频率，并报告了有希望的结果（16-18）。表一总结了低剂量IL-2治疗自身免疫性疾病的初步临床研究（15-17，19-23）。

使用高风险的角膜移植模型，我们的研究小组先前已经证明，低剂量的IL-2治疗可以增加Treg频率和功能，而CD41IFN-y1Th细胞（Teffs）的扩张最小，并显著提高小鼠的移植存活率（24）。尽管有这些有希望的结果，低剂量IL-2治疗的疗效一直受到限制，因为短t1/2的IL-2（12）。为了克服这一障碍，我们发现了一种IL-2特异性单克隆抗体（JES6-1A12，称为JES6-1），它可以增加IL-2t1/2，同时将IL-2的活性集中在CD细胞上，从而将其对CD细胞的影响减至最小，从而防止高剂量IL-2的潜在副作用。这些副作用源于毛细血管通透性增加导致血管渗漏综合征，导致低血压、肺水肿、肝充血导致肝细胞损伤和肾功能衰竭（25）。在实验模型中，低剂量的IL-2与抗IL-2Jes6-1mab联合应用。已知JES6-1与一个IL-2位点结合，该位点对与CD（IL-2Rb）的相互作用至关重要，但对与CD25（IL-2Ra）的结合不那么重要；这与另一个IL-2单抗S4B6相反，后者与一个IL-2位点结合，该位点部分阻断与CD25的结合，但不妨碍与CD的结合。因此，IL-2/S4B6Ab复合物对肿瘤免疫治疗和骨髓移植后T细胞数量的增加具有重要的临床意义。相反，IL-2/JES6-1复合物（IL-2c）选择性扩张Tregs有助于治疗自身免疫性疾病（7）。在过敏性气道疾病的小鼠模型中，IL-2c通过在体内扩大Tregs来降低过敏性肺部炎症的严重程度（26）。在自体免疫性脑炎的实验模型（27，28）中，它也显示出增加皮肤和胰岛细胞移植的存活率和有效地减轻炎症。本文就近年来低剂量IL-2在移植、自身免疫和其他炎症性疾病中的应用作一综述。我们还讨论了进一步研究的潜在领域，目的是优化目前使用的低剂量IL-2治疗方案。

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低剂量IL-2在移植中的应用

低剂量IL-2在胰岛细胞移植的实验模型中进行了首次的研究，其中i.p.注射IL-2c（28）。作者发现，在每天注射3次IL-2（1mg）和5mg单克隆抗体后，第3天脾脏可达到最大Treg扩张。在这个方案中，CDFoxp31树突状细胞在CD41脾细胞中的频率从10.3%增加到57.4%。作者进一步证明，用上述方案对IL-2c预处理小鼠使其对实验性自身免疫性脑炎（EAE）的诱导产生抵抗，并在没有免疫抑制的情况下诱导对完全MHC不相容的胰岛细胞的耐受，导致大多数移植物被无限期接受（28）。IL-2c治疗在皮肤移植中的各种异基因组合中的作用也已被研究；特别是，IL-2c在单一MHCⅡ类差异的小鼠模型中已被证明能扩大树突，抑制Th1异基因反应，并提高存活率（29）。在小鼠角膜移植模型中，我们已经证明低剂量的IL-2治疗能显著提高移植物的存活率。我们证明，从移植前3天开始，直到移植后1周，单独注射IL-2（每天注射1毫克的i.p.注射液），然后每周注射两次，直到移植后6周，可增加Treg频率，改善其免疫抑制功能和长期移植物存活率（24）。这是首次研究表明，单用低剂量IL-2可以诱导移植存活。以前的角膜移植报告显示，在角膜移植存活率方面，使用IL-2和雷帕霉素（与单独使用IL-2相比）具有优势（30）。我们认为，在我们的模型中，为了持续扩张Tregs和防止移植排斥反应，需要频繁注射IL-2。此外，在移植前开始IL-2治疗可以在异敏反应前扩大Treg群体，防止移植排斥反应。如上所述，低剂量IL-2治疗已与阻断Teff反应的干预措施结合使用。在小鼠皮肤移植模型中，发现IL-2加入雷帕霉素后，可增加移植小鼠的Tregs，降低Teff活化，显著延迟皮肤排斥反应，而单独注射两种分子中的一种分子（27）未观察到这种效应，可能是因为Treg和Teffs与IL-2同时扩张，雷帕霉素同时抑制Treg和Teffs的增殖。

低剂量的IL-2治疗也被用来诱导Tregs的扩张，作为先前在自身免疫和移植中抑制Th1激活的策略的辅助手段。例如，IL-2被添加到钙调神经磷酸酶抑制剂（CNI）中，如他克莫司或环孢素A。CNIs阻断TCR诱导的NFAT向细胞核的移位，从而阻断Teff功能和IL-2转录（31）。因此，这些药物被证明限制了IL-2作为Treg生长因子的有效性，导致Treg数量减少，如肝和肾移植患者所示（32）。此外，皮肤移植的实验研究表明，从他克莫司处理的小鼠身上采集的Tregs抑制Teff增殖的效率较低。然而，在他克莫司治疗中添加IL-2c可挽救Treg表型，使Treg抑制特性正常化，恢复暴露于CNIs的Treg的存活和抑制特性，并改善小鼠皮肤移植中的移植物存活率（32）。抑制Teff反应的另一个策略是用CTLA4-Ig阻断共刺激机制；这种方法在改善肾移植患者肾功能方面优于环孢素（33），这就提出了在扩大Treg数目或增强Treg功能的同时抑制效应器功能的联合治疗可能是实现免疫耐受的一种有价值的策略。因此，在Charbonnier等人的一项研究中，我们研究了CTLA4-Ig和IL-2诱导的Treg扩张对同种异体移植物存活的影响。与最初的推测相反，作者证明CTLA4-Ig通过抑制Treg的稳态和抑制能力来阻止外源性IL-2治疗诱导的移植物接受。因此，在设计基于共刺激阻断的耐受协议时，应考虑对Treg功能的抑制（34）。

低剂量IL-2治疗自身免疫性疾病

最早的临床报道之一是低剂量IL-2治疗造血干细胞移植后难治性GVHD（15，35）。自本报告发表以来，低剂量IL-2已被广泛用作调节Treg稳态的调节因子，用于治疗各种自身免疫性疾病（36）。临床试验中提出了不同的治疗方案，以验证低剂量IL-2治疗和预防GVHD的有效性和安全性。早期研究表明，成功地使用了s.c.IL-2，最大耐受剂量为每天万IU/m2的体表面积，持续8周，间断4周后可重复使用。在这些患者中，有相当比例的人观察到慢性移植物抗宿主病症状减轻；在23名患者中，12名患者有涉及多个部位的主要反应（15）。进一步的研究提出了预防GVHD的类似方案[例如，s.c.每天注射低剂量IL-2（万IU/m2）14天，然后间断14天（37天），或每周注射3次0.1-20万IU/m2，持续0-90（38）天]。提示预防性应用低剂量IL-2可有效地促进早期Treg扩张，抑制急慢性GVHD（35，36）。在丙型肝炎病毒（HCV）引起的血管炎患者中，给药1.5–IU/dIL-2共10天，发现大多数患者的临床症状明显改善，其中9例患者的冷球蛋白血症减少，8例患者的血管炎改善（19）。

低剂量的IL-2给药也显示了治疗T1D患者的疗效，T1D患者的Tregs表现为功能失调，并且在IL-2产生和IL-2信号传导方面存在相对不足（39）。因此，外源性IL-2被认为可以恢复与IL-2/IL-2R信号缺陷相关的受损Treg功能（40-42）。低剂量IL-2在T1D中的首次剂量定义试验由Hartemann等人发表。（16）年，旨在确定在已建立的T1D患者中，能够安全地扩张和激活Tregs的最低有效剂量的IL-2。本研究表明，每日s.c.注射0.33-万IU/dIL-2连续5天，以剂量依赖的方式有效地扩张Tregs，对Teffs或NK细胞的影响最小。在较高剂量（万IU/d）下，尽管Tregs扩张更为明显和持久，但仍观察到NK细胞扩张和更频繁的轻中度副作用。因此，作者建立了一个33-万IU/d的剂量范围，通过这个剂量范围，Tregs可以在T1D中安全、特异地被扩大。根据这项研究的结果，一项针对新发T1D患者的疗效试验已经开始(临床医生.gov标识符NCT）。低剂量IL-2治疗也被用来恢复SLE患者的Treg功能。系统性红斑狼疮患者T细胞产生IL-2的受损最早出现在20世纪80年代（早在Tregs发现之前）（43）。最近，一些研究表明，这些患者的CD41T细胞缺乏IL-2的产生，导致了Tregs中CD25表达的缺失，而低剂量IL-2（17、18、43）的刺激可以选择性地逆转CD25的表达。此外，来自小鼠模型的数据表明，SLE中IL-2缺乏是由于慢性激活的Teffs和记忆性T细胞置换产生IL-2的T细胞，而记忆性T细胞则丧失了表达IL-2的能力（17、18）。年4月，第一例活动性SLE患者接受了重组人IL-2（rhIL-2）的非标记治疗；观察到疾病活动性的快速和强劲降低，这与Treg人群的显著扩张（43）平行。这一发现与发表在丙型肝炎相关血管炎患者身上的研究结果一致（19，21）。随后，年4月，同一组进行了一项I/IIa联合试验，探讨了在活动性和难治性SLE患者中重复和周期性应用低剂量IL-2的安全性、耐受性、临床疗效和免疫反应。该方案包括四个治疗周期，每个周期包括连续5天每天以0.75、1.5和万IU的单次剂量注射rhIL-2（aldesleukin），间隔9-16天（43）。

在另一项研究中，38例SLE患者接受了3个周期的rhIL-2皮下注射，每隔一天注射万IU，持续2周，然后进行2周的中断治疗。低剂量rhIL-2治疗可选择性地增强Tregs，减少滤泡Th细胞和Th17细胞的数量，但不增加Th1或Th2细胞的数量；这伴随着SLE患者疾病活动性的显著降低。本研究进一步证明，低剂量IL-2治疗能够改变Teff与Treg的平衡，改善SLE患者的临床预后（27）。目前，多期I/II期临床试验正在进行中，使用低剂量IL-2治疗11种不同的自身免疫性疾病，包括类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、系统性红斑狼疮和几种血管炎。最常用的治疗方案是皮下注射万IU/d的IL-2，持续5天，然后每2周注射一次，持续6个月。在所有这些情况下，Tregs均成功扩张，对Teffs无任何影响，这表明低剂量IL-2在自身免疫性疾病中具有潜在的治疗作用（44）。今后需要对低剂量IL-2治疗这些疾病进行随机试验，以确定低剂量IL-2治疗这些疾病的疗效及其在这些患者中潜在的皮质类固醇保留效应。利用IL-2/抗IL-2复合物增加IL-2的t1/2在不同的自体免疫动物模型中的研究与移植模型相似。韦伯斯特等人。结果表明，在多发性硬化模型中，用IL-2-JES6-1单抗预处理小鼠3d只导致轻度EAE的神经症状。为了研究IL-2c治疗对EAE进展的影响，在EAE诱导后，从激发后第2天（即免疫反应早期）开始，用IL-2c、雷帕霉素或两者治疗小鼠3d。在这个方案中，单独注射雷帕霉素或IL-2c可以延缓临床症状的出现；然而，所有的小鼠最终都发展成了严重的疾病。相反，雷帕霉素和IL-2c联合治疗可显著降低疾病的严重程度，显示出更强的治疗效果（28）。在Izquierdo等人最近的一项研究中。（45）使用NOD小鼠，IL-2c治疗与多克隆和Ag特异性Foxp31树突的扩展有关。IL-2c治疗还扩展了Ag特异性Foxp32产生IL-10的T细胞，这些T细胞能持续很长时间，导致糖尿病的完全预防和胰岛浸润的最小化。在狼疮性肾炎小鼠模型中，IL-2c显著减轻肾小球和肾小管损伤、血管炎评分、IgG和补体成分3（C3）在肾脏的沉积。

在IL-2c治疗的小鼠（46）的血清中，高水平的抗双链DNA抗体和免疫球蛋白水平以及低水平的补体水平等疾病活动标记得到改善。IL-2c治疗还降低了肾脏中TNF-a和IL-6的表达，降低了肾脏和脾脏中产生IFN-g1IL-17的CD41T细胞的频率。重要的是，与类固醇和霉酚酸酯的联合治疗相比，IL-2c治疗显示出可比的或更好的疗效，并通过扩大Tregs保护狼疮易感小鼠免受狼疮性肾炎的影响（46）。此外，IL-2c治疗已被证明对类风湿关节炎小鼠模型有效，在该模型中，连续三天的腹腔注射IL-2c可导致Treg扩张，抑制滑膜细胞增殖和IL-17、IL-6和TNF-a水平。它还降低了IFN-g1产生IL-17的细胞的频率，扩大了脾脏产生IL-10的树突（47）。尽管IL-2c治疗在实验模型中取得了成功，但抗IL-2的人单抗的使用仍在研究中，需要进一步的研究来确定这种方法在人类中的安全性和有效性。

低剂量IL-2治疗其他炎症疾病

Treg缺乏已在多个炎症场景中显示。结果表明，慢性肾脏病患者外周血Tregs的频率明显低于正常人，IL-2可选择性地扩增Tregs，上调Foxp3的表达。研究还表明，在慢性肾脏疾病患者中，STAT5的激活对于IL-2诱导的Treg的扩张和Foxp3mRNA的表达是必需的，这支持了肾小球疾病中的临床Treg损伤的发现以及在这些患者中进行低剂量IL-2治疗的理据（48）。同样，在缺血性心脏病和急性冠状动脉综合征患者中，低剂量IL-2治疗正在通过I/II期随机双盲对照试验进行研究。在这项正在进行的临床试验中，患者将随机接受s.c.剂量的IL-2（aldesleukin；剂量范围0.3-万IU）或安慰剂，每天一次，连续5天。将研究5种不同的剂量水平，并根据初始反应确定剂量。这项研究着眼于aldesleukin的安全性和耐受性，也旨在确定增加Treg水平75%（49）的剂量。在动物模型中，研究了IL-2c治疗在不同炎症条件下的作用。在小鼠肾缺血再灌注损伤（IRI）模型中，从损伤诱导前5d开始，每天三次注射IL-2c，成功地扩大了Tregs，降低了炎症细胞和细胞因子水平以及肾组织的凋亡（50）。有趣的是，IRI发生后给予IL-2c也会增加Treg频率，从而改善肾小管细胞增殖和肾功能，减少肾纤维化。最近，在诱导心肌虹膜前给予IL-2c可诱导心脏Treg扩张，减少炎性细胞的组织浸润和凋亡，减少Th1和Th17细胞的频率和炎性细胞因子的表达，从而改善心肌功能（49）。在短暂性缺血性卒中的实验模型中，IL-2c治疗可以诱导Treg的扩张，并通过Treg促进CD39和CD73的表达，这与它们的免疫抑制功能有关（51）。此外，在食物过敏小鼠模型中，IL-2c治疗联合舌下免疫治疗逆转了IgE介导的过敏，减少了脾细胞分泌IL-5，增加了口腔和十二指肠粘膜固有层IL-10和TGF-b的表达（52）。在硬化性胆管炎的小鼠模型中，随着IL-2c的肝内树突扩张，骨桥蛋白（一种促生长的细胞因子）和肿瘤坏死因子-a的肝内表达下调，肝内CD81淋巴细胞的频率降低，胆管损伤和纤维化减少。此外，IL-2c治疗可上调Tregs中CD39的表达。小鼠硬化性胆管炎肝CD81T淋巴细胞介导胆汁损伤和纤维化。它们的增殖通过对IL-2c有反应的嘌呤能途径被肝Treg控制，提示Treg指导的低剂量IL-2可能是硬化性胆管炎的一种治疗方法（53）。最后，在与输血相关的急性肺损伤（TRALI）中，每天静脉注射重组小鼠IL-2（1mg/kg）或IL-2c，其中包括IL-2和抗IL-2的混合物，比例为1:10（即，1mg重组小鼠IL-2和10mg小鼠IL-2Ab），在诱导TRALI之前连续5天防止水肿的发生，降低肺蛋白水平和抑制肺中性粒细胞聚集的促炎因子（54）。本研究表明，TRALI的疾病进展与Th17和Treg反应的改变有关，外源性IL-2和IL-2c的加入有可能预防TRALI的发生。

未来方向

低剂量IL-2治疗在移植、自身免疫和各种炎症性疾病的免疫恢复中有着广阔的应用前景。在T1D、SLE和缺血性心脏病中使用IL-2的多个临床试验正在进行中。在T1D患者中进行了剂量发现试验，以优化IL-2的剂量和给药频率，使其在不扩张Teffs或NK细胞的情况下对Tregs的影响最大化（16）。一个现存的挑战是单独使用时IL-2的t1/2较短，这就需要重复注射。通过将IL-2与JES-6mab结合，在实验模型中克服了这一障碍，这使得Treg扩增和Foxp3表达显著增强，对Teff群体的影响最小（28、29、45-47、50-55）。这些结果证明有必要将这些知识转化为人类的知识。最近，一种新的抗人IL-2ab被发现可以在不阻断Treg-pSTAT5通路的情况下抑制Teff对IL-2的反应（56）。这是人类抗-IL-2抗体的第一个有力证据，该抗体可在治疗上用于特异性靶向人类树突并诱导耐受。在最近的一项研究中，一种在药理学上优越且具有特异性的人IL-2被设计成优先结合并激活表达高水平IL-2Rabg的细胞，并有可能用于治疗自身免疫性疾病和其他免疫性疾病。这种方法以前是通过增加IL-2与a链的亲和力来探索的（57）。另一种方法是降低IL-2对b链的亲和力，以降低IL-2激活CD41、CD81-Teffs和NK细胞上IL-2R的能力，这些细胞主要通过受体的中间亲和力形式（IL-2Rbg）发出信号。该IL-2mutein与效应沉默人IgG1结合，增强其药理作用t1/2，增强其对高亲和力IL-2Rabg的亲和力。这种新的IL-2分子在体外、人全血pSTAT5检测和猴子体内均具有高度的Treg选择性（58）。其体内给药激活并扩展了CD41和CD81CDFoxp31树状细胞。这种增强的和选择性的Treg反应有可能恢复大多数自身免疫性疾病中扰乱的3免疫内环境（58）。这些新的治疗方法对不同的免疫细胞亚群有更高的选择性，可以作为一个强有力的潜在工具，在移植、自身免疫和各种炎症性疾病中诱导免疫平静，并减少对广泛免疫抑制药物的依赖，如皮质类固醇和细胞毒性药物。

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